Purifikasi adalah proses mengisolasi untuk menghilangkan kontaminan dalam suatu senyawa (britannica.com). Hasil murni dari proses pemurnian yang berhasil disebut isolat. Metode purifikasi pada HPLC dibagi menjadi tiga, yaitu analitis, semi-preparatif dan preparatif. Apa perbedaan ketiganya? bagaimana cara menentukan metode purifikasi yang tepat? dan bagaimana alur kerja purifikasi pada HPLC? Mari kita bahas.
Perbedaan Metode Purifikasi Analitis, Semi-Preparatif, dan Preparatif
Perbedaan utama dari ketiga metode tersebut terletak pada tujuan dari masing-masing metode. Metode analitis bertujuan untuk mengidentifikasi dan melakukan analisis kualitatif dan kuantitatif senyawa dalam campuran sampel. Karena tujuan tersebut, senyawa (dan sisa sampel) hanya dialihkan ke detektor seperti spektrometer massa atau charged aerosol detector (CAD). Metode analitis biasanya dipakai pada proses hulu & hilir, seperti meningkatkan hasil produk atau mengisolasi senyawa murni untuk karakterisasi cyro-EM. Perbedaan lainnya adalah dari sisi volume sampel, volume cenderung kecil (beberapa mikroliter atau kurang) karena ini cukup untuk identifikasi dan analisis senyawa. Di samping itu, metode analitis menggunakan kolom & laju alir yang berada di bawah 4,6 mm dan 2 mL/menit. Eluen (fase gerak) keluar sebagai waste.
Sedangkan, tujuan metode preparatif adalah memurnikan dan mengumpulkan senyawa yang diinginkan dalam sampel Anda. Dalam metode preparatif, senyawa yang dipisahkan dikumpulkan dalam wadah terpisah untuk diproses lebih lanjut. Metode ini dibentuk karena kebutuhan untuk memperkaya atau memurnikan senyawa target dalam industri makanan dan farmasi. Hasil purifikasi metode preparatif digunakan untuk penelitian atau sebagai suplemen makanan, farmasi atau bioterapi misalnya. Berbeda dengan eluen pada metode analitis, eluen diteruskan ke fraction collector. Metode preparatif diterapkan dalam pemurnian komponen berskala besar & sering digunakan untuk tujuan manufaktur. Kolom dan laju alir berkisar dari 50 – 200 mm dan 50+ mL/menit.
Metode terakhir, yaitu semi-preparatif. Semi-preparatif biasanya digunakan untuk pemurnian skala kecil dalam pembuatan hingga alur kerja, seperti mengisolasi senyawa untuk analisis struktural. Metode ini menggunakan kolom dan laju alir dari 10 – 30 mm dan 5 – 50 mL/menit.
Apa yang Menentukan Skala Metode Preparasi HPLC Anda?
Dua hal yang menentukan skala dan jenis metode preparatif LC yang Anda pilih untuk purifikasi:
- Ketersediaan dan Hasil Sampel
Jumlah absolut dari hasil produk yang ingin Anda isolasi tentu saja bergantung pada ketersediaan sampel. Hal ini akan membuat perbedaan jika Anda melakukan penguraian protein skala kecil, sejumlah kecil probe molekuler yang disintesis, atau mencoba memurnikan batch pembuatan protein skala besar. Untuk batch protein skala besar, Anda mungkin akan inject volume sampel yang besar secara manual, atau bahkan dengan pompa peristaltik atau kolom yang dikemas secara manual.
- Tantangan untuk memurnikan
Ketika menentukan skala metode preparasi LC, motivasi Anda untuk isolasi atau purifikasi tergantung pada area aplikasi. Faktor ini mungkin lebih sering mengarah pada keputusan untuk tidak meningkatkan laju alir untuk purifikasi. Alasannya mungkin karena sudah ada metode analisis yang mapan dan tanpa perlu penskalaan metode, jadi Anda hanya ingin membersihkan fraksi saja. Tidak perlu menyesuaikan metode gradien. Anda bisa melakukan purifikasi berulang, misalnya, analit target senyawa biologis yang keluar dari proses skala awal. Dalam kasus lain, hasil purifikasi yang tinggi dengan resolusi tertinggi diperlukan untuk mengisolasi peak Anda dari impurities, jika tidak, sampel tidak dapat digunakan. Sampel yang dimurnikan memiliki nilai yang sangat besar dan membutuhkan kolom UHPLC ukuran partikel kecil yang dioperasikan pada laju alir kecil untuk purifikasi.
Metode Analitis Juga Bersifat Semi-Preparatif
Salah satu contohnya adalah purifikasi rantai oligonukleotida, memerlukan purifikasi n-1 mers pada resolusi yang sangat tinggi. Instrumentasi canggih dapat membantu Anda mengatasi tantangan dalam mempertahankan resolusi analitis juga untuk purifikasi, dengan fraction collector yang dilengkapi teknologi cerdas, seperti delay volume otomatis, desain fluida yang dioptimalkan, dispersi yang diminimalkan, dan penurunan carryover antar fraksi.
Sebagai contoh, Sistem Purifikasi Analitis Thermo Scientific™ Vanquish™ digunakan untuk pemurnian semi-preparatif oligonukleotida dengan Fraction Collector Thermo Scientific™ Vanquish yang terintegrasi.
Gambar 1. Purifikasi kromatografi cair fase terbalik semi-preparatif oligonukleotida. Laju aliran adalah 5 mL/menit pada kolom dengan ID 10 mm. Volume injeksi adalah 500 µL. Dalam kondisi ini, kami dapat mengisolasi peak target dari pengotor dan isomer peak target.
Alur Kerja Purifikasi HPLC
Hal penting yang perlu diketahui bagi orang yang baru menggunakan HPLC sebelum mereka melakukan purifikasi skala analitis:
- Ketahui jenis sampel yang ingin Anda purifikasi.
- Ketahui tempat penyimpanan sampel yang tepat.
- Perhatikan juga kondisi penyimpanan sampel. Anda harus mengetahui karakteristik sampel, apakah sensitif terhadap cahaya atau temperatur,organik atau biomolekul.
Workflow purifikasi pada LC:
Sumber:
Dr. Sussane Fabel. 2023. HPLC Purification: When to Use Analytical, Semi-Preparative & Preparative Methods. www.thermofisher.com/blog
Timothy Cross. 2017. Analytical vs. Preparative Liquid Chromatography. www.thermofisher.com/blog
