Pemilihan peptida yang sesuai, penting untuk menghasilkan antibodi peptida yang baik. Setiap antibodi memiliki empat polipeptida (peptida yang terdiri dari dua atau lebih asam amino). Antibodi memiliki kode antibodi yang terdiri dari serangkaian karakter atau angka unik. Kode antibodi berfungsi sebagai “nama panggilan” yang memudahkan peneliti, produsen, dan pengguna lainnya untuk merujuk pada antibodi yang sama tanpa harus menuliskan seluruh deskripsi lengkapnya. Pemetaan peptida akan membantu dalam menentukan bagian spesifik dari protein yang terikat oleh antibodi.

Apa itu Pemetaan Peptida?

Pemetaan peptida berfungsi untuk mengidentifikasi struktur protein primer (urutan asam amino dan modifikasi kimia). Pemetaan ini diperlukan karena pesatnya antibodi monoklonal dan obat protein rekombinan pada industri farmasi. Selain itu, juga merupakan langkah dalam pemantauan proses produksi dan jaminan kualitas/kontrol kualitas (QA/QC) untuk memastikan tidak ada perubahan yang  terjadi pada produk. Kegagalan dalam memetakan peptida dapat menghambat pengembangan dan kemampuan reproduksi obat.

Eksperimen pemetaan peptida dilakukan pertama kali dengan reduksi dan alkilasi ikatan disulfida yang diikuti dengan pencernaan enzimatik menggunakan protease. Protease yang paling umum digunakan untuk pemetaan peptida antibodi monoklonal (mAb) adalah tripsin, yang membelah secara spesifik pada terminal C residu arginin (R) dan lisin (K). Kemudian, peptida dipisahkan dengan kromatografi cair fase terbalik yang digabungkan dengan spektrometri massa. Ketika pemetaan dilakukan dengan prosedur ini, urutan asam amino dari setiap peptida dapat dikonfirmasi secara individual. Selain itu, modifikasi kovalen seperti glikosilasi, oksidasi, atau deamidasi dapat diidentifikasi dengan cara yang spesifik.

Pentingnya Pemilihan Kolom untuk Pemetaan Peptida

mAbs mengalami berbagai modifikasi enzimatik dan kimiawi yang dapat memengaruhi stabilitas, kemanjuran, dan keamanan produk obat secara keseluruhan. Hal ini disebut atribut kualitas kritis (CQA) dan dapat berkisar dari kandungan pengotor, seperti adanya tingkat PTM tertentu pada tulang punggung protein. Analisis PTM dapat menjadi tantangan karena perbedaan kimiawi yang sering kali tidak kentara antara peptida yang tidak dimodifikasi dan spesies yang dimodifikasi, sehingga membutuhkan pemisahan kromatografi yang efisien.

Oleh karena itu, pemilihan kolom yang tepat akan memisahkan peptida dalam campuran dengan efisiensi tinggi, sehingga menghasilkan data yang akurat dan dapat diandalkan. Karakteristik kolom dapat secara langsung memengaruhi kinerja pemisahan. Kolom Hypersil GOLD Peptide reversed-phase C18 direkomendasikan untuk pemetaan peptida yang berbeda dalam hal kimiawi dengan berbagai muatan karbon, ukuran partikel (µm), luas permukaan (m2 /g), ukuran pori rata-rata (Å), dan volume pori (mL/g).

Kolom Hypersil GOLD Peptide reversed-phase C18 memberikan hasil analisis yang sangat baik untuk berbagai jenis sampel. Kolom ini terbuat dari silika murni dan dirancang khusus untuk mengurangi efek ‘tailing’ (pelebaran puncak) yang sering terjadi pada analisis menggunakan metode gradien. Dengan kemampuan memisahkan komponen sampel dengan sangat baik, efisien, dan sensitif, kolom Hypersil GOLD memastikan hasil analisis akurat dan terpercaya.

Pemetaan melibatkan pemotongan protein menjadi peptida-peptida yang lebih kecil menggunakan enzim atau metode kimia, diikuti dengan analisis urutan peptida tersebut untuk mengidentifikasi fragmen protein yang penting. Dengan metode ini, kita bisa memastikan urutan asam amino penyusun protein tersebut dan mendeteksi perubahan kimia yang terjadi setelah protein diproduksi, seperti deamidasi atau glikosilasi. Ini sering dilakukan dengan cara memecah protein menjadi peptida yang lebih kecil menggunakan enzim protease, seperti tripsin.

Application note ini, membandingkan tiga lot kolom Hypersil GOLD Peptide dengan empat kolom dari empat vendor berbeda. Tujuan evaluasi ini untuk melihat karakterisasi tingkat peptida biofarmasi dan menggambarkan kinerja lot-ke-lot yang konsisten. Kinerja kolom dievaluasi dengan menyelidiki cakupan urutan, pemisahan modifikasi pasca-translasi, retensi peptida hidrofobik dan hidrofilik, dan carry-over.

Berikut hasil penilaian perbandingan keempat kolom:

A. Penilaian Cakupan Sequence

Cakupan sekuens dievaluasi menggunakan perangkat lunak BioPharma Finder berdasarkan data MS/MS. Peta cakupan sekuens ditampilkan untuk rantai berat rituximab untuk masing-masing kolom yang diuji (Gambar 3).

B. Penilaian Area Peak, Reproduksibilitas RT, Asimetri Peak, dan Akurasi Massa

Perbandingan data secara mendalam di lima kolom berdasarkan beberapa parameter (Tabel 1) termasuk reprodusibilitas area peak (area peak %CV ≤ 10), reprodusibilitas waktu retensi (RT %CV ≤ 2), asimetri peak, dan akurasi massa (≤ 5 ppm).

C. Penilaian Resolusi Kromatografi 

Gambar 4 menunjukkan kromatogram ion yang diekstraksi untuk peptida dari lima kolom yang diuji. Peak utama yang dilabeli sebagai peak 1 sesuai dengan bentuk peptida yang tidak dimodifikasi, sedangkan peak 2 dan peak 3 mewakili dua spesies terdeamidasi yang terelusi sebelum dan sesudah peak utama.

D. Penilaian Retensi Peptida Hidrofilik

E. Penilaian Carry-Over

Evaluasi carry-over selanjutnya dilakukan dengan menghitung kelimpahan relatif dari sinyal peptida hidrofobik untuk dua injeksi blank berturut-turut yang dianalisis setelah enam injeksi rituximab tryptic digests.

F. Penilaian Kuantifikasi PTM

Aspek kunci untuk menunjukkan analisis pemetaan peptida yang kuat dan andal bergantung pada kuantifikasi PTM yang paling relevan. Untuk alasan ini, kadar PTM dievaluasi untuk sampel rituximab melalui Chromeleon CDS, termasuk deaminasi, pembentukan suksinimida, oksidasi, dan pembentukan piroglutamat ujung-N (PyroGlu) dan konten lisin terminal-C (Lys). Data reproduksibilitas pada masing-masing kolom yang diuji tercantum di Tabel 4.

Dari data-data perbandingan antar kolom di atas, dapat disimpulkan bahwa kolom Hypersil GOLD Peptide menghasilkan peak dengan nilai asimetri yang baik, memberikan reproduktifitas waktu retensi yang kuat, pemisahan peptida hidrofilik, dan memiliki nilai resolusi kromatografi yang sangat baik untuk spesies yang terdeamidasi di wilayah PENNYK. Di samping itu, memfasilitasi pendeteksian berbagai macam CQA dengan tingkat reproduktifitas yang kuat yang tercatat di tiga lot kolom yang berbeda. Variabilitas lot-ke-lot yang rendah ini memberikan kepercayaan diri dalam analisis, khususnya jika diperlukan dalam lingkungan QC.

Jika Anda memiliki pertanyaan terkait kolom Hypersil GOLD Peptide, silakan hubungi ccs@wiralab.co.id

Penulis: Putri Kurnia

Editor: Luthfia P.