Sistem Vanquish Neo UHPLC Thermo Fisher Scientific menetapkan standar kinerja baru untuk proteomik bottom-up nano LCMS single-shot
Penelitian proteomik bottom-up berusaha untuk mengidentifikasi dan mengukur proteom lengkap di dalam sel, jaringan, atau organisme. Ketika kedalaman profil proteom meningkat, wawasan tentang proses fisiologis yang kompleks dan pengaruhnya terhadap fenotipe, yang berpotensi mengarah pada kemajuan di berbagai bidang termasuk penemuan biomarker dan pengobatan presisi juga meningkat. Keragaman yang besar dan rentang dinamis protein yang ditemukan dalam biofluida seperti plasma manusia atau sel memerlukan alat dengan sensitivitas tinggi, spesifisitas tinggi, dan pengukuran yang kuat. Dalam pembuatan profil proteom yang dalam, metode berbasis nano-LC menggunakan kolom panjang dan gradien dangkal yang digabungkan dengan High Resolution Mass Spectrometry (HRMS) yang digunakan untuk mengkarakterisasi dan mengidentifikasi peptida dan protein sebanyak mungkin. Selama 20 tahun terakhir telah terlihat inovasi signifikan dalam instrumentasi LC-MS untuk pemisahan dan deteksi peptida dalam digest serta dalam kekuatan alat analisis yang diperlukan untuk menganalisis kumpulan data yang semakin kompleks.
Salah satu metrik kunci untuk mengukur kinerja dalam kromatografi gradien adalah kapasitas puncak, atau jumlah maksimum teoritis dari puncak yang dapat diselesaikan sepenuhnya dalam pemisahan. Pada kapasitas puncak yang lebih tinggi, lebih banyak peptida yang diselesaikan secara kromatografi yang mengarah pada peningkatan sensitivitas untuk peptida tingkat rendah dan menjadi lebih banyak identifikasi. Untuk kromatografi cair fase terbalik, kapasitas puncak sebanding dengan akar kuadrat dari panjang kolom. Meningkatkan kapasitas puncak membutuhkan partikel yang lebih kecil atau kolom yang lebih panjang, yang keduanya meningkatkan tuntutan tekanan pada instrumen nano-LC. Gradien yang lebih panjang (dangkal) juga telah terbukti meningkatkan kapasitas puncak peptida dalam pemisahan kromatografi fase terbalik. Alur kerja proteomik klasik menggunakan kolom ID 75 µm yang dikemas dengan partikel 2 µm yang dioperasikan pada laju alir dari 200 hingga 500 nL/menit. Dalam kondisi seperti itu, penggunaan kolom yang lebih panjang dari 50 cm sangat membatasi keluaran sampel (dalam beberapa kasus hanya beberapa sampel/hari). Langkah-langkah pencucian dan ekuilibrasi yang bersamaan ditambah dengan system dead volume semakin membatasi throughput sampel dan pemanfaatan MS.
Sementara penurunan diameter kolom dapat menyebabkan peningkatan sensitivitas metode, kontributor utama peningkatan sensitivitas pada laju alir nano dan kapiler adalah hubungan terbalik antara laju alir dan efisiensi ionisasi elektrospray (ESI). Selain itu, laju alir yang lebih rendah mampu meningkatkan pengambilan sampel analit oleh spektrometer massa dan mengurangi penekanan ionisasi oleh komponen matriks. Dengan demikian, upaya untuk mengurangi waktu analisis overhead harus fokus pada peningkatan kecepatan pemuatan sampel dan keseimbangan kolom sambal mempertahankan laju alir rendah selama pemisahan sampel dan langkah akuisisi data MS. Demikian pula, upaya untuk menjaga volume penundaan gradien seminimal mungkin, dengan menggunakan desain sistem nano-LC volume rendah bersama dengan konfigurasi fluidic yang dioptimalkan merupakan pertimbangan penting untuk memaksimalkan throughput analisis dan pemanfaatan MS dalam analisis nano-LCMS. Atribut penting lainnya dalam alur kerja proteomik adalah reproduktifitas kolom ke kolom. Meskipun kapasitas puncak yang tinggi memungkinkan pembuatan profil proteom yang dalam, tanpa pemisahan yang dapat direproduksi di beberapa kolom mungkin akan sulit untuk menarik kesimpulan yang andal.
Di sini kami mendemonstrasikan kemajuan terbaru nano-LCMS menggunakan sistem Vanquish Neo UHPLC Thermo Scientific yang digabungkan dengan spektrometer massa Orbitrap Exploris 480 Thermo Scientific untuk pembuatan profil proteome dalam pencernaan protein sel HeLa. Kemampuan tekanan yang diperluas, UHPLC Vanquish Neo Thermo Scientific menghasilkan pemisahan yang sangat reproducible dari ID 75 µm × 50 cm dan ID 75 µm × 75 cm kolom PepMap Neo untuk meningkatkan kapasitas puncak dan membuka pintu untuk kemungkinan menjalankan kolom pemisahan yang lebih lama lagi untuk mencapai kinerja pemisahan yang tak tertandingi. Pemuatan sampel dan ekuilibrasi yang cepat dimungkinkan melalui tingkatan tekanan 1500 bar pada sistem UHPLC dan bahan habis pakai, menghasilkan throughput metode yang lebih baik dan peningkatan pemanfaatan MS. Selain itu, prosedur pencucian jarum tingkat lanjut meminimalkan sisa sistem tanpa membuang waktu siklus kerja MS yang berharga. Dengan metode gradien 4 jam, identifikasi 80.000 peptida dan lebih dari 7000 protein dalam eksperimen nanoLCMS single-shot dengan mode data-dependent acquisition (DDA) dan lebih dari 80% pemanfaatan MS untuk alur kerja injeksi sampel langsung tercapai.
Untuk artikel lengkapnya silahkan klik link di bawah ini :
There are no reviews yet.
