Banyaknya volume analit yang mengalir di dalam sistem HPLC, akan mempengaruhi kualitas bentuk peak. Sehingga, memahami perbedaan masing-masing volume sangatlah penting. Hal ini dapat membantu menyelesaikan permasalahan, seperti bentuk peak yang lemah dan transfer metode. Sebagian dari Anda mungkin sudah familiar dengan dead volume, dwell volume, dan extra column volume. Namun, sepertinya masih ada kebingungan terkait konsep dari ketiga volume tersebut.
Bagaimana dead volume, dwell volume, dan extra column volume terjadi? Bagaimana meminimalisir ketiganya? Dan efek apa yang ditimbulkan dari ketiganya pada sistem HPLC?
Yuk, simak penjelasan di bawah ini.
Dead Volume HPLC
Istilah dead volume sering salah digunakan sebagai extra column volume. Sebenarnya, dead volume pada HPLC mengacu pada volume analit di dalam sistem kromatografi yang tidak tersapu oleh fase gerak. Dead volume dapat terjadi mulai dari titik injeksi sampai ke titik deteksi, kecuali kolom. Jadi, ini meliputi volume injeksi, volume injektor, volume pipa penghubung sebelum dan sesudah kolom, volume end-fittings dan frits serta volume sel aliran detektor.
Mengapa mengetahui dead volume penting?
Karena, dead volume terkait dengan efisiensi pemisahan dan berdampak besar pada lebar serta bentuk peak.
Konsep dead volume dapat dijelaskan sebagai berikut: bayangkan sebuah peak analit atau pita kromatogram yang mengalir di antara dua tabung, di mana kedua tabung dihubungkan oleh sebuah penghubung (1). Saat pita bergerak memasuki penghubung, analit dalam larutan sampel menyebar, dan akan mengisi volume pada tabung kedua (2). Bayangkan, pita pada penghubung, disapu oleh fase gerak untuk menuju ke tabung kedua. Namun, saat pita bergerak menuju tabung selanjutnya, pergerakan ini akan memakan waktu yang lebih lama bagi sebagian pita untuk mencapai tabung selanjunya. Sebab, pita mencapai sudut-sudut penghubung melalui difusi (3). Penundaan terisinya volume ini, menyebabkan asimetri peak atau peak tailing (4).
Solusi terbaik untuk menghindari tailing puncak adalah memastikan semua sambungan di jalur aliran sampel memiliki dead volume minimal. Dengan bantuan Thermo Scientific Viper dan Thermo Scientific nanoViper Fingertight Fittings hampir meniadakan dead volume. Hasilnya, akan menghindari terjadinya distorsi peak dan meminimalkan pelebaran pita kromatogram.
Extra Column Volume
Extra Column Volume (ECV) merupakan semua volume dari loop sampel ke detektor, kecuali volume di dalam kolom. Dead volume mempengaruhi sebagian terjadinya extra column volume. Volume di sistem HPLC ini, dipengaruhi oleh komponen fisik sistem, termasuk needle seat, konektor pipa ke kolom, detector flow cells, preheaters, dan lain-lain. Selain itu, juga dipengaruhi oleh kondisi metode, misal volume injeksi dan penyaringan detektor.
ECV dikategorikan menjadi dua, yaitu pre-column volume dan post-column volume. Pre-column volume adalah semua volume di dalam jalur aliran sampel, mulai dari titik injeksi sampai ke inlet kolom. Pre-column volume yang lebih besar akan menghasilkan pelebaran pita kromatogram. Sebab, waktu yang dibutuhkan agar pita berdifusi keluar, lebih banyak. Volume ini ditentukan dari needle seat dan tubing penghubung.
Usaha meminimalkan efek pre-column volume, yaitu pelebaran pita kromatogram, paling terasa dalam pemisahan isokratik dibandingkan dengan pemisahan gradien. Volume kolom yang lebih rendah akan lebih dipengaruhi oleh pelebaran pita extra column. Karena, rasio pelebaran pita di kolom ke ekstra kolom, rendah yang berarti efek ekstra-kolom adalah bagian yang signifikan dari pelebaran pita keseluruhan.
Efek extra column volume di HPLC sangat terlihat pada pemisahan isokratik, tapi pemisahan gradien tidak berdampak besar karena pemfokusan peak pada head kolom. Namun, extra column volume dapat mempengaruhi resolusi karena resolusi didasarkan pada lebar peak.
Sementara itu, post-column volume merupakan segala bagian setelah outlet kolom. Terlepas dari jenis pemisahan (isokratik dan gradien), post-column volume sangat berpengaruh terhadap efisiensi. Sederhananya: semakin banyak post-column volume, semakin banyak waktu yang dibutuhkan pita analit untuk terdisfusi sebelum deteksi dan semakin banyak resolusi yang akan hilang.
Beberapa solusi untuk mengatasi volume pada pre dan post column antara lain: minimalkan panjang tubing, hilangkan dead volume karena sambungan yang buruk, dan pilih tubing inner diameter (ID) yang sesuai dengan dimensi kolom. Penting diingat: tekanan balik (back pressure) sebanding dengan 1/tubing radius2. Jadi, jika Anda memotong tubing ID menjadi dua bagian, tekanan yang dibutuhkan untuk mengalirkan laju aliran yang sama, dikalikan dengan faktor 4!
Dwell Volume
Konsep dwell volume di HPLC lebih sederhana dibandingkan kedua volume sebelumnya. Dwell volume menggambarkan perbedaan volume antara perangkat yang mengontrol pengiriman gradien dan head kolom. Volume ini juga dikenal sebagai gradient delay volume (GDV). GDV mencakup volume total dari titik pencampuran fase gerak ke inlet kolom termasuk, pump head, tubing, mixer, loop sampel, dan katup apapun di jalur aliran. Akibat dari GDV adalah gradien elusi yang terprogram, tertunda saat memasuki kolom. Perhitungan penundaan ini dapat dihitung dengan rumus:
Delay time = GDV : flow rate
Beda instrumen HPLC, berbeda juga GDV yang dimiliki. Namun, jika Anda hanya mengkhawatirkan pemisahan isokratik, Anda dapat menghiraukan GDV. Sebab, komposisi fase gerak, konstan. Sehingga, tidak ada penundaan yang terjadi antara pompa dan kolom.
Jenis pompa merupakan faktor utama dalam menentukan sistem gradient delay volume. Pompa dibagi menjadi dua kategori berdasarkan pembentukan gradien: pompa gradien tekanan rendah dan tekanan tinggi. Pompa bertekanan rendah berkontribusi lebih besar pada GDV.
- Pencampuran fase gerak terjadi sebelum mencapai kepala pompa pada tekanan rendah, dalam pompa gradien tekanan rendah. Volume katup proporsional, pompa tubing inlet, dan kepala pompa mempengaruhi GDV. Kontributor utama pada GDV, seringnya datang dari pompa itu sendiri. Kebanyakan quaternary pump termasuk ke kategori pompa gradien tekanan rendah.
- Pompa gradien tekanan tinggi memiliki beberapa kepala pompa dan pencampuran terjadi setelah melalui kepala pompa. Kepala pompa dan inlet tubing tidak berkontribusi pada GDV. Pompa gradien tekanan tinggi umumnya hanya berkontribusi kecil dari total GDV. Binary pump termasuk dalam kategori ini.
GDV mempengaruhi selektivitas analit, waktu retensi, dan bentuk peak. Saat mentransfer metode antar HPLC, Anda perlu memahami GDV di setiap sistem HPLC. Hal ini sangat penting untuk mendapatkan hasil yang sebanding dan menghindari validasi metode yang tidak perlu.
Tidak hanya waktu retensi absolut yang ditentukan oleh GDV, tetapi juga profil gradien. Perataan profil gradien ini, menjadi faktor utama ketika mencoba mencocokkan bentuk peak dan urutan elusi. Kit transfer metode dapat menyelesaikan gradient delay volume pada sistem HPLC dengan mudah.
Jika Anda memiliki permasalahan terkait volume di sistem HPLC, sila diskusi dengan tim kami melalui sales@wiralab.co.id
Sumber:
