Resolusi adalah indikator yang dinilai dari seberapa cepat dan lengkap komponen target dalam sampel dapat terpisah dari saat melewati kolom. Resolusi diukur dengan membagi perbedaan waktu retensi peak dengan lebar peak rata-rata. Kegagalan dalam resolusi dapat memengaruhi keakuratan dan keandalahan hasil analisis.
Baseline resolution of peaks (resolusi dasar dari puncak) menjadi tujuan untuk setiap analisis HPLC. Tanpanya (non-baseline resolution or co-eluting peaks), akan berdampak pada kemampuan Anda untuk mengkaji data dengan cepat dan memperkenalkan variabilitas dalam analisis Anda. Inilah alasan mengapa mengoptimalkan resolusi analisis berbanding lururs dengan peningkatan kualitas data.
Namun, dari mana kita harus memulai untuk mengoptimalkan resolusi HPLC?
Panduan di bawah ini dapat membantu Anda secara sistematis untuk memaksimalkan peak di HPLC. Berikut adalah daftar yang perlu diperiksa:
5 hal yang perlu diperhatikan untuk memperbaiki resolusi peak
-
Preparasi Sampel dan Sistem
Partikulat dan pengotor dapat menyebabkan sensitivitas yang lebih rendah, degradasi kolom, peningkatan baseline noice, dan lebih banyak efek negatif pada kromatogram Anda. Berikut langkah yang perlu Anda lakukan di tahap ini:
-
- Preparasi Sampel
Preparasi sampel yang merupakan langkah pertama dari setiap analisis, sehingga langkah awal di mulai dari tahap ini. Filtrasi atau ekstrasksi yang tepat berdasarkan persyaratan dari aplikasi dan sistem Anda yang menghilangkan partikulat dan pengotor akan meningkatkan resolusi peak.
-
- Vial Sample
Perhatikan karakteristik analit Anda. Interaksi yang tidak diinginkan dengan wadah sampel dapat berdampak pada konsentrasi analit secara keseluruhan, menyebabkan variasi lebar puncak & resolusi. Bagi analit yang peka terhadap cahaya, cegah degradasi dengan memilih kaca berbahan amber. Berbeda halnya dengan analit yang bersifat hidrofobik/hidrofilik. Analit tersebut mengharuskan Anda memilih wadah yang mencegah pengikatan yang tidak diinginkan pada permukaan wadah.
-
- Komposisi Fase Gerak
Komposisi fase gerak seperti rasio pelarut air/organik, pH fase gerak, dan kekuatan buffer ionic dapat berdampak pada resolusi. Anda dapat mempelajari tips & trick fase gerak HPLC di sini.
-
- Pemilihan Kolom
Sama pentingnya dengan fase gerak, fase diam kolom juga penting ketika mengoptimalkan resolusi HPLC. Pertimbangkan ukuran partikel dan ukuran pori fase diam, hal ini akan meningkatkan resolusi dan efisiensi. Umumnya, semakin panjang kolom maka, ukuran partikel semakin besar. Kolom dipilih berdasarkan hasil analisis yang ingin dicapai.
2. Pompa
-
- Laju Alir
Dalam kebanyakan kasus, menurunkan laju aliran akan menurunkan faktor retensi di outlet kolom, membuat peak lebih sempit dan memberikan faktor respons yang lebih baik. Sedangkan, meningkatkan laju alir dapat menyebabkan peak melebar, menurunkan resolusi, tetapi akan mempersingkat waktu pengoperasian.
Kolom yang dikemas dengan partikel yang lebih kecil atau partikel solid-core memberikan manfaat dalam mempertahankan resolusi peak yang tinggi pada laju alir yang lebih cepat.
3. Autosampler
-
- Volume Injeksi
Parameter volume injeksi yang akan mengubah resolusi Anda adalah konsentrasi sampel, kapasitas kolom, dan sensitivitas detektor. Dalam kebanyakan kasus, semakin banyak sampel yang Anda injeksikan ke dalam kolom, membuat peak melebar. Waktu retensi dapat berkurang dan berdampak negatif pada efisiensi dan resolusi kolom. Faktor ini dikenal sebagai kelebihan massa. Membebani kolom dengan menaruh terlalu banyak sampel juga akan memaksimalkan batas detektor. Aturannya, Anda harus menyuntikkan 1-2% dari total volume kolom (untuk konsentrasi sampel 1µg/µl).
4. Column Copartment
-
- Temperatur Kolom
Suhu wadah kolom berperan besar dalam efisiensi dan selektivitas pemisahan. Suhu yang lebih tinggi memungkinkan laju aliran yang lebih dan analisis yang lebih cepat. Namun, dapat menyebabkan degradasi sampel dan resolusi yang lebih rendah. Sedangkan, suhu yang lebih rendah akan membuat retensi lebih tinggi yang mana meningkatkan resolusi peak. Tapi, di sisi lain, analisis akan menjadi lebih lambat.
Pastikan Anda mengetahui batas suhu untuk sampel, pelarut, kolom, dan instrumentasi Anda, dan secara perlahan sesuaikan parameter sesuai dengan panduan ini.
-
- Sistem Backpressure
Saat mengalirkan fase gerak melalui kolom/sistem HPLC, Anda akan melihat adanya tekanan tertentu yang dihasilkan. Istilah ini sering disebut tekanan sistem backpressure. Tekanan backpressure yang meningkat atau berlebihan dapat berarti penyumbatan atau degradasi kolom. Perawatan, pembersihan, dan/atau penggantian kolom yang tepat dapat mengembalikan sistem Anda ke penggunaan yang optimal.
Selalu mengacu pada prosedur dan panduan yang direkomendasikan oleh produsen kolom untuk perawatan dan teknik pembersihan kolom yang optimal.
5. Detektor
Setelah Anda menentukan detektor yang tepat untuk analisis Anda, saatnya memastikan bahwa resolusinya sudah sesuai. Parameter yang harus Anda pertimbangkan adalah:
-
-
- Panjang Gelombang: ketika menggunakan detektor UV-VIS, Anda dapat menemukan panjang gelombang yang optimal dengan mengevaluasi spektrum serapan analit. Teknik ini meminimalkan gangguan dan memberikan sensitivitas yang lebih baik.
- Waktu Respon: Patokan umumnya adalah Anda harus mengatur waktu respons pada sepertiga dari lebar peak di setengah tinggi puncak peak.
- Akuisisi Data: Terlalu sedikit titik data dapat memengaruhi bentuk peak, reproduktifitas, dan presisi area. Minimal 20, tapi idealnya 30-40 titik data per peak diperlukan untuk resolusi peak yang optimal.
-
Jangan Lupa Rawat HPLC Anda!
Walaupun Anda sudah berhasil memperbaiki resolusi peak HPLC Anda, pekerjaan Anda tidak berhenti sampai di sini. Anda juga harus merawatnya agar HPLC Anda berjalan secara optimal dan konsisten.
Berhati-hatilah saat mematikan HPLC, membersihkan, dan pemeriksaan servis rutin. Semua ini penting untuk pemeliharaan instrumen dan tentunya menjaga resolusi tetap baik selama bertahun-tahun.
Sumber:
