Pemilihan dan perawatan kolom HPLC menentukan keberhasilan analisis metode Anda. Kolom berperan penting dalam pemisahan komponen dalam sampel. Pada dasarnya, setiap jenis kolom kromatografi bekerja dengan cara yang sama. Sampel melewati kolom dengan bantuan fase gerak. Sampel akan berjalan melalui fase diam pada tingkat yang berbeda. Sehingga, menyebabkan komponen dalam sampel akan memisah seiring waktu.

Bagi sebuah HPLC, kolom yang digunakan tergolong sebagai komponen terpenting. Kolom harus mampu menahan backpressure yang diciptakan selama penggunaan. Juga, harus menyediakan jalur aliran (bebas bocor, volume minimum, dan dead volume) untuk sampel di inlet dan pita analit di outlet. Sehingga, karakteristik fisik serta kimia dari kolom, mempengaruhi performa kromatogram.

Tapi, bagaimana Anda mengetahui kolom HPLC yang tepat untuk eksperimen Anda? Serta, bagaimana cara merawat kolom HPLC yang benar? Simak tips di bawah ini.

Pemilihan Kolom HPLC yang Tepat

Pastikan, Anda harus mengetahui tujuan pemisahan Anda. Misal, apakah Anda akan melakukan fase normal atau fase terbalik di HPLC. Dalam fase normal, fase diam adalah hidrofilik (bersifat polar). Sedangkan, fase diam adalah hidrofobik (non-polar). Sehingga, analit yang dipisahkan bersifat non polar.

Kebalikan dengan fase terbalik, yang lebih umum digunakan. Fase gerak pada fase terbalik adalah hidrofilik. Sementara itu, fase diam adalah hidrofobik. Dengan demikian, molekul dielusi dengan menurunkan polaritas melalui penggunaan pelarut organik.

Kedua jenis kolom tersebut yang paling umum tersedia di berbagai merek. Sebenarnya, masih banyak jenis kolom lainnya, seperti ion exchange, HILIC, mixed-mode, dan lain lain. Setelah mengetahui tujuan pemisahan, yang harus Anda lakukan adalah menentukan kebutuhan aplikasi. Contohnya, kebutuhan resolusi, tingkat sensitivas, biaya operasional, dan lama waktu kolom bisa digunakan.

Bagi pengguna liquid chromatography (LC) dari Thermo Fisher Scientific, pemilihan kolom hanya membutuhkan waktu kurang dari 5 menit! Anda cukup mengakses link thermofisher.com/order/lc-column-guide/#!/quiz. Selanjutnya, Anda tinggal menjawab beberapa pertanyaan sesuai dengan aplikasi riset Anda. Mudah bukan?

Jenis Kolom HPLC

Dari banyaknya tipe kolom yang beredar, kolom HPLC tipe Acclaim didesain dengan ukuran pori yang lebih kecil dan luas permukaan yang lebih tinggi. Sehingga, hasil pemisahan beresolusi tinggi dan efisiensi yang tinggi. Acclaim memiliki beragam jenis kolom yang disesuaikan dengan fungsionalnya, antara lain: kolom fase terbalik & general purpose, mixed-mode, application- specific, dan size exclusion (SEC).

• Kolom Fase Terbalik & Tujuan Umum

Sistem pada kolom fase terbalik HPLC, fase geraknya adalah hidrofilik (polar). Sedangkan, fase diam merupakan hidrofobic (non-polar). Sistem ini kebalikan dari kolom fase normal. Fase gerak di kolom fase normal bersifat hidrofobik dan fase diamnya bersifat hidrofilik.

Selain kedua jenis kolom tersebut, ada kolom HILIC. Kolom HILIC kuat menahan senyawa yang tidak tertahan oleh fase terbalik konvensional, tanpa memerlukan aditif pasangan ion.

Beberapa contoh kolom tipe ini antara lain: Acclaim 120 C18, Acclaim 120 C8, Acclaim 300 C18, Acclaim Polar Advantage, Acclaim C30, dan Acclaim HILIC-10. Ukuran partikel kolom bervariasi mulai dari 2.2 µm dan 5µm dengan surface area 100 m²/g dan 300 m²/g. Aplikasi eksperimen yang tepat bagi kolom ini adalah fat-soluble vitamin, steroid, phthalates, acetic acids, artificial sweeteners, cocoamidopropyl betaine, dan lain-lain.

• Kolom Mixed-Mode

Kolom mixed-mode berfungsi memisahkan analit ionic dan hidrofobik dalam sekali analisis. Kemampuan multifungsi ini mampu mengurangi masalah penggantian kolom, pemasangan kolom, atau penggunaan kolom secara seri. Fase diam kolom mixed-mode mencampur fungsi kolom fase terbalik dan pertukaran ion atau HILIC. Kolom memiliki ukuran partikel mulai dari 3 µm dan 5 µm dengan surface area 100 m²/g dan 300 m²/g .

Contoh aplikasi yang bisa digunakan analisis adalah phospholipids, kombinasi pereda sakit, antibiotic, suplemen diet, dan lain-lain. Kolom yang termasuk jenis mixed-mode adalah Acclaim Trinity P1 LC, Trinity P2 LC, Mixed Mode WCX-1 LC, Mixed Mode WAX-1 LC, dan OmniPac PAX-100 HPLC.

• Kolom application-specific

Kolom application-specific dirancang khusus untuk aplikasi farmasi dan lingkungan. Kolom ini memberikan resolusi superior dengan penggunan yang sangat mudah. Kolom application-specific bisa digunakan untuk surfaktan, aminoglycoside, carbamate, explosives, Polyaromatic Hydrocarbons (PAHs), dan obat-obatan. Contoh kolom yang termasuk application specific antara lain Acclaim Carbamate LC, Carbonyl C18 LC, Surfactant LC, dan Explosives E2. Ukuran partikel bervariasi mulai 2.2 µm, 3 µm, dan 5 µm.  Kolom application specific memiliki surface area dari 100 m²/g dan 300 m²/g.

• Kolom Size Exclusion (SEC)

Pemisahan pada kolom SEC berbeda dari fase terbalik dan metode pemisahan kromatografi lainnya. Mode SEC sebagian besar bergantung pada interaksi analit dengan fase dian, SEC membedakan molekul berdasarkan ukuran molekul menggunakan kolom yang dikemas dengan partikel berpori. Fase diam dirancang untuk meminimalkan setiap interaksi dengan analit. Sebab, interaksi sekunder antara analit dan partikel kolom dapat berdampak negatif terhadap retensi. Berbeda dari tipe kolom lainnya, ukuran partikel kolom 5 µm dan 7 µm.

Umumnya, kolom SEC digunakan untuk memisahkan molekul biologis, menentukan distribusi berat molekul protein dan peptide, serta memisahkan daftar panjang polimer larut air. Selaras dengan itu, kolom SEC dibedakan lagi berdasarkan aplikasinya. Misalnya, untuk pemisahan monoclonal antibody, pemisahan protein dan peptide, dan polimer larut air. Contoh jenis produk kolom SEC adalah Acclaim SEC 300 & 1000.

Perawatan Kolom HPLC

Sebelum dilakukan pembersihan, pastikan tidak ada buffer atau sampel pada kolom dan pelarut yang digunakan. Berikut panduan pembersihan kolom:

• Media Fase Terbalik

Pertama, kolom dibilas dengan HPLC grade water; selama proses pembilasan ini, injeksikan 4 alikuot 200µL DMSO. Setelah itu, bilas menggunakan methanol. Lalu bilas dengan chloroform dan terakhir menggunakan methanol.

• Media Fase Normal

Pembersihan dilakukan dengan membilas kolom menggunakan tetrahydrofuran. Kemudian, bilas dengan methanol. Lalu, dilanjutkan dengan tetrahydrofuran. Bilas lagi dengan methylene chloride. Terakhir, bilas dengan benzene-free n-hexane.

• Media Pertukaran Anion

Untuk media pertukaran anion, kolom dibilas dengan HPLC grade water, gradien 50mM sampai 1M larutan buffer yang sesuai. Kemudian, bilas dengan methanol. Thap akhir, bilas menggunakan chloroform.

• Media Pertukaran Kation

Kolom dibilas menggunakan HPLC grade water; selama proses pembilasan ini, injeksikan 4 alikuot 200µL DMSO. Selanjutnya, bilas dengan tetrahydrofuran.

• Media Protein Size Exclusion

Ada dua prosedur pembersihan yang berkaitan dengan penghilangan kontaminan dari media protein size exclusion. Pertama, bagi protein yang ditahan dengan lemah, pembilasan kolom dilakukan menggunakan 30mL 0.1 M pH3.0 buffer fosfat. Sedangkan bagi protein yang ditahan dengan kuat, kolom dibilas selama 60 menit menggunakan 100% air sampai 100% gradien asetonitril.

Jika Anda ingin mengetahui kolom mana yang paling sesuai dengan kebutuhan lab Anda, sila lihat panduan pemilihan kolom atau bisa berdiskusi dengan tim kami melalui sales@wiralab.co.id