HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) adalah instrumen yang saat ini banyak digunakan di berbagai laboratorium. Instrumen ini secara komersial mulai diproduksi pada tahun 1970. Sampai saat ini, HPLC telah digunakan di berbagai industri, seperti makanan dan minuman, farmasi, keamanan lingkungan, dan manufaktur.
Sebenarnya, apa sih HPLC? Dan bagaimana cara kerjanya?
Mari kita jabarkan.
Apa itu HPLC?
HPLC adalah metode yang digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan mengukur senyawa dalam campuran kimia. Pemisahannya memanfaatkan aliran fase gerak yang digerakkan oleh tekanan melalui kolom yang dikemas dengan fase diam.
Fase gerak membawa sampel cair melalui kolom menuju detektor. Analit akan terpisah karena berbagai tingkat interaksi dengan fase diam.
Detektor mengukur analit setelah di elusi dari kolom dan chromatography data system (CDS) menerjamahkan sinyal yang terdeteksi. Grafik output data dari analisis HPLC dinamakan kromatogram, sumbu X menunjukkan waktu dan sumbu Y merupakan sinyal yang dihasilkan oleh detektor.
Bagaimana Prinsip Kerja HPLC?
Umumnya, perangkat keras utama dalam HPLC ada empat: pompa, autosampler, kolom, dan detektor.
Analisis pada HPLC dimulai saat sampel diinjeksi dalam jumlah tertentu. Pompa akan mendorong eluen melalui sistem dengan laju alir tertentu. Kemudian, sampel bergerak dari titik injeksi lalu mengalir masuk ke dalam aliran fase gerak menuju kolom.
Berbagai jenis kolom yang tersedia dengan bahan penyerap / pengisi kolom dalam berbagai ukuran dan permukaan partikel. Penentuan kolom didasarkan pada metode aplikasi Anda, misalnya proteomik, molekul kecil, atau bio. Baca Tips Memilih dan Merawat Kolom HPLC.
Pemisahan senyawa secara fisik terjadi di fase diam kolom. Senyawa bergerak melalui kolom dengan kecepatan yang berbeda dan berinteraksi dengan bahan penyerap, inilah yang disebut sebagai fase diam. Faktor-faktor yang mempengaruhi kecepatan pergerakan setiap komponen, yaitu sifat kimiawi, sifat kolom, dan komposisi fase gerak. Setelah elusi dari kolom, komponen sampel yang terpisah bergerak ke detektor. Analit tertentu dideteksi berdasarkan sinyal listrik yang dihasilkan oleh property tertentu. Kemudian, sinyal analit yang terdeteksi oleh CDS disebut sebagai kromatogram, di mana grafiknya sumbu X adalah waktu dan sumbu Y adalah sinyal analit.
Apa Saja yang Mempengaruhi Pemisahan Senyawa di HPLC?
Banyak faktor yang mempengaruhi pemisahan, seperti komposisi fase gerak, bahan kimia penyerap / pengisi kolom, dan suhu. Pemisahan yang berhasil hanya terjadi jika analit memiliki afinitas yang berbeda untuk kolom.
Faktor utama yang mempengaruhi proses pemisahan adalah:
- Sifat fisiokimia dari analit: ukuran, muatan, polaritas, dan volatilitas
- Sifat fisiokimia dari fase diam: polaritas, muatan, dan viskositas
- Sifat fisiokimia dari fase gerak yang digunakan dan interaksi dengan analit dan fase diam
Beragam Jenis Teknik Kromatografi Cair
Dari pemisahan skala nano hingga preparatif, berikut adalah jenis teknik HPLC yang paling umum dan kapan harus menerapkannya.
|
Teknik Kromatografi Cair |
Cara Kerja |
Aplikasi |
| HPLC (High Performance Liquid Chromatography) | HPLC dioperasikan pada tekanan di bawah 700 bar dengan laju alir antara 1-2 mL/menit | QA/QC molekul kecil dan besar untuk bidang farmasi, industri bahan kimia, dan keamanan pangan |
| UHPLC (Ultra High-Performance Liquid Chromatography) | Tekanan lebih dari 1000 bar dan laju aliran 0,2 – 0,7 mL/menit. Resolusi dan sensitivitas lebih baik dan penggunaan pelarut lebih sedikit dibanding HPLC. | Research and development (R&D), farmasi, dan biofarmasi untuk pengembangan dan karakterisasi obat molekul kecil, peptide, dan antibody. |
| LC-MS | Sepktrometer massa pengganti detektor optic tradisional seperti detektor UV-Vis. | Umumnya digunakan untuk analisis peptida dan protein. |
| Low-flow Liquid Chromatography | Kromatografi cair aliran rendah mencakup rentang aliran nano, mikro, dan kapiler yang berkisar dari nL/menit hingga sekitar 50 µL/menit. | Cocok untuk pengukuran molekul dengan sensitivitas tinggi dalam matriks biologis yang kompleks. |
| Preparative Liquid Chromatography | Melibatkan pengumpulan eluen yang telah difraksinasi ke dalam wadah sampel terpisah untuk mengisolasi satu atau beberapa analit guna memisahkan pengotor |
Pemurnian obat dalam skala besar atau kecil untuk meingkatkan hasil produk. |
Pemisahan Isokratik vs Gradien
Pemisahan di HPLC dibagi menjadi dua metode, yaitu isokratik dan gradien.
- Metode isokratik: menggunakan komposisi eluen yang konsisten selama analisis, seperti 100% asetonitril atau campuran 50:50 antara asetonitril dan air.
- Metode gradien: mencakup perubahan komposisi fase gerak selama pemisahan. Metode ini menggunakan dua pelarut disebut A dan B. Proses pemisahan dimulai dengan persentase tertentu dari A ke B, seperti 60% air hingga 40% asetonitril.
Pemisahan HPLC vs GC
Pemisahan HPLC terjadi berdasar interaksi antara senyawa dengan fase diam dan fase gerak. Sedangkan pemisahan GC (gas chromatography), terjadi berdasar volatilitas masing-masing senyawa.
Sama seperti HPLC, GC juga menggunakan fase diam dan fase gerak. Namun, fase gerak GC berupa gas yang tidak reaktif atau inert yang tidak menyerap zat lain, contohnya gas hidrogen. Sebagai tambahan, fase diam GC berupa partikel silika kecil atau bahan kimia lain yang secara selektif menarik molekul tertentu.
Cari tahu sejarah perjalanan HPLC Thermo Fisher Sientific di sini.
Jika Anda tertarik mempelajari HPLC atau UHPLC, silakan diskusi dengan tim kami sales@wiralab.co.id
Sumber:
